丘イサミ、月影トシ、雪見ソウシの三人は幕末に活躍した新撰組の子孫。ある日、花丘家の蔵で新撰組の秘密基地を発見し、光を放つ不思議な剣を手に入れた。そして、世界征服と花丘魁博士（イサミの父）の誘拐を企む悪の秘密組織「黒天狗党」と戦っていく。
初期は少年探偵ものの方向性で、「しんせん組」で巷で起こる事件を追い、主にイサミが剣を用いて悪党と戦うという内容だった。中盤から黒天狗党が本格的に暗躍し始め、しんせん組もパワーアップを果たして「ヒーローもの」の方向にシフトしていく。
新撰組発明係とその子孫
幕末の新撰組の別働隊。花丘家･月影家･雪見家の先祖である。 人の精神力をエネルギーに変える鉱石・ルミノタイトを研究、3つの武器を発明した。カラクリ人形に仕込まれたフィルムでメッセージを伝えるが肝心なところでフィルムが終わってしまう。
花丘一作
声 - 掛川裕彦
月影十郎
声 - 石井康嗣
雪見千助
声 - 梅津秀行
しんせん組
花丘イサミ
声 - 中嶋美智代（現：中嶋ミチヨ）
本作の主人公。小学5年生の帰国子女。ボーイッシュな女の子。大江戸小学校に転校生としてやってきた。勉強・スポーツは得意だが母似で絵が下手。自宅の蔵から発見した龍の剣（りゅうのつるぎ）を振るって戦う。通常、剣は六角形の柄の部分しかないが、発動時は光の刃が現れる。
初期は3人で掛け声を叫ぶことで剣を発動して、イサミが敵と戦闘を行っていた。剣で斬られた相手はシビレて動けなくなり、一部の記憶を失う。
後に「龍の印は正義の印、この世に悪がある限り、天に代わって悪を断つ、新選組参上!!」の部分はしんせん組参上のときの決めゼリフへと代わった。
名前の由来は近藤勇。
月影トシ
声 - 亀井芳子
イサミのクラスメイト。初対面だったイサミの胸を誤って触ってしまって以降、イサミとはいがみ合うことが多い。「バーチャル戦隊 ガンバマン」の大ファンだが、「魔法の妖精 ラブリン」といった女児向け番組もこっそり見ている。ことわざを時々、口にするが大抵は間違える。
中盤以降では龍の目を使用して戦うようになった。大きめのスーパーボール程度のサイズだが、発動時は光が外殻部分を形成する。外殻の大きさを変えて野球ボールのように投げて使用するときと、サッカーボールのように蹴って使用するときがある。
名前の由来は土方歳三。
雪見ソウシ
声 - 日高のり子
イサミのクラスメイト。冷静沈着だがキザで女好き。美人を見ると見境なく言い寄り、どこからともなく薔薇を取り出し差し出す。その反面、女性に関して悲惨な目にあうことも多い。「恐るべし、○○○」という言い回しで場を締めることが多い。中盤以降では龍の牙を使用して戦う。普段は根元が四角い2本の牙だが、発動時は2つを光がつなぎ弓の形状をなす。
名前の由来は沖田総司。
月影ケイ
声 - 三田ゆう子
トシの弟。好奇心旺盛な幼稚園児。三輪車でいつも移動しており、自転車で行動する3人からは置いてけぼりを食らうことも多い。しかし持ち前の機転でイサミたちのピンチを救ったこともある。先祖の遺したからくり三輪車が登場してからは、それで速く移動したり空を飛んだりできるようになった。兄と同じくガンバマンの大ファンであり、魁が変装したガンバマンキングに助けられてから彼に憧れるようになった。。
名前の由来は山南敬助。
花丘家
花丘邸は近所では「三丁目のお化け屋敷」と呼ばれている。
花丘観柳斉
声 - 北村弘一
イサミの祖父。玲子に変わって家事全般をこなし、料理も得意である。クマのぬいぐるみが大好きで「大江戸クマさん友の会」の会員でもある。また、武術にも長け、剣（ハリセン）では複数のカラス天狗を簡単に倒し、槍では鎧天狗と渡り合い見事勝利している。たまに浪曲をやったりし、魁も聞かされたことがあるらしい。
終盤では「謎の人物『怪傑白頭巾』」となって、しんせん組を助けて黒天狗党と戦う。本人はあくまで「謎の人物」と言い張っているが、どこからどう見ても観柳斉なので、敵味方問わず正体はバレバレである。（変身（変装?）自体はしんせん組と大差ないので、若干の不公平感はあるが。）
名前の由来は武田観柳斎。
花丘玲子
声 - 井上喜久子
イサミの母親。ニュースキャスターであり、「花丘玲子のおはよう7」のメインキャスターを務める。しっかりした母親であるがどこか少々抜けたところがある。料理が苦手だった（不気味な色の料理を作る）が克服したのか、最終話では（見栄えは非常にいい）ご馳走を作っている。
花丘魁
声 - 石井康嗣
イサミの父親。ルミノタイトを研究していた物理学者。黒天狗党に追われているため正体を隠すべく顔にミイラのような包帯、目にサングラス、頭に黒い帽子、全身にはコートと完全に誰だかわからない、しかしどこか怪しい格好をしている。瑠美野流忍術の修行を積んでおり、戦闘のスキルも非常に高い。前半では、（イサミの誕生日にバラを贈っていたことから）「野ばらの男」と名乗っていた。イサミ達のピンチの際にガンバマンキングに変装して現れることもあった。
木登りが得意で、花丘邸が見える丘の木の上から1人つぶやく場面が多かった。
名前の由来は島田魁。
坂本数馬
声 - 小野健一
イサミの叔父（玲子の弟）。独身。大江戸警察の刑事である。様々な事件を追うもイサミ達にヒントをもらったりなど少々頼りない。はるかに惚れており熱心にストーカー同然のアプローチするが、ことごとく空回りしている。「捜査のついで」の名目でたびたび花丘家に飯を食いに来る。後半はルリ子にもほれていた。
名前の由来は坂本龍馬。
月影家・雪見家
月影家
父親の泰之は「芹沢ジャパン」に勤務している課長。
月影泰之 声 - 掛川裕彦
月影園絵 声 - 堀越真己
雪見家
「雪見堂」という本屋である。
雪見栄助 声 - 梅津秀行
雪見オリエ 声 - 稀代桜子
大江戸小学校
高木はるか
声 - 佐々木瑶子
イサミ達のクラスの担任。子供のように無邪気で天然な性格だが、実は瑠美乃一族の末裔で、くノ一として黒天狗党と戦い、イサミ達しんせん組をサポートする。アニメや特撮ものが好きなようで、部屋には雑誌やグッズが所狭しと並んでいる。くノ一の時は、グラマーな赤い忍装で露出度が多いハイレグレオタードのインナーコスチュームとなっている。以前、瑠美野流で修行していた魁のことを「お兄ちゃん」と呼んでいた。
清川マユコ
声 - 井上喜久子
イサミ達のクラスメイト。ポニーテールとリボンがトレードマーク。ソウシにお熱なため、何かと共に行動しているイサミやトシに度々ちょっかいをかけている、おませさん。イサミとはあらゆる意味で対極（本人はライバル視。嫌っているわけでは無いらしい）に位置する存在。
イズミ
声 - 渡辺久美子
イサミ達のクラスメイト。長い髪がトレードマークの静かな女の子。よくマユコと一緒にいる。霊感があらしく、何かと先々に起こるトラブルを予知することがある。マユコと同じく、ソウシに一途な様子。
貫太郎
声 - 高乃麗
イサミ達のクラスメイト。ぽっちゃりとした少年。大のUFOマニア。学園祭の際にはガラクタから作る、リサイクルロボの設計と製作を指示した。ゴールデン天狗や新撰組も宇宙人と思い込んだ。
黒天狗党
『ダッシュ』では、正義の軍団となっている。
黒天狗（芹沢鴨之丞＜テン・グー星人セリ・カーモン＞）
声 - 西川幾雄
黒天狗党の会長にして芹沢ジャパンの会長。世界征服を目論み、そのためにルミノタイトを狙っている。イサミの祖父、観柳斉とは良きライバルとして長年張り合い続けている。一方でイサミの事は、まるで本当の孫のように可愛がっている。実は200年前地球に不時着した宇宙人でルミノタイトも彼等が所持していたもの（龍の剣と同形状の武器も所有する）。故郷の星に対する望郷の念から、宇宙船新造の願いを抱き続け、そのための財力と人力を欲するが故に世界征服を目論んでいた、というのが実情である。ルミノタイトの力で若返りを繰り返しており、終盤は中年の男性になっている。
漫画版では本来の目的である宇宙船新造が叶うも地球を離脱計画の直前で、実は母星帰還反対派のリーダーだった銀天狗によるクーデターが勃発。黒天狗党を追われて、しんせん組に助けられ「望郷のためとはいえ、自らが力に任せて弱き者を踏みつけにしようとし、また自らの可愛がってきた子どもたち（四天王のうち鎧天狗、銀天狗、ゴールデン天狗の3名）にもそれを当然の事と教え続けてきた」という自らのしでかしてきた過ちを深く悔いた。そして、しんせん組と銀天狗との戦いの後、事情を慮ったイサミたちの願いにより、龍の武器から取り出され花丘博士によって精製されたルミノタイト100によって無事に遠き星への帰途に着いた。
名前の由来は芹沢鴨、ちなみに彼は元水戸天狗党。
南蛮天狗（芹沢鴨之丞の秘書）カルタ 掛川裕彦・カステラ
芹沢会長の秘書であり、黒天狗党の№2的存在。ルミノタイトの力を吸収する力を持つ。その正体は黒天狗のペットであり宇宙船の整備士だった白い犬である。
黒天狗四天王
鎧天狗（芹沢ルリ子、18?）
声 - 梅津秀行/堀越真己
鎧に身を包んでおり、武術（主に剣と槍）を使用して戦う。からくり天狗といがみ合うことが多い。実はその正体は鴨之丞の孫・ルリ子である（但しルリ子の親は鴨之丞の養子のため、実の孫ではない。なお劇中で正体が判明したのが一番遅い。）。ルリ子本人は若い女性（大学生）だが、鎧天狗はなぜか男性の声で古風なしゃべり方をしている。鎧天狗の格好をしているときはルリ子と呼ばれることを嫌う。数馬に言い寄られた際、軟弱・へらへらした男は嫌いだとはねつけているが、健（銀天狗）のアプローチには反発しつつもまんざらでもない様子。また、ソウシに言い寄られたときは顔を真っ赤にして動揺したことからショタコンの気もあるようである。
からくり天狗（東上別府鷹丸、12?47）
声 - 津田英三
その名のとおり、体中にからくりを仕込んでいる。ドリルモグラ、ロコモービル等、主に黒天狗党内でのメカニック系の開発を担当している。甥の菊丸を自らの生命と断言し男手一つで育てている。菊丸のために世界征服を自らの野望としており、そのためには卑怯な手も辞さなかった。そのため終盤、黒天狗の目的を知り幻滅。ゴールデン天狗と共にクーデターを起こすが失敗、黒天狗党を抜けて新撰組に最後の勝負を挑んだ。表の顔は芹沢電工代表取締役。
漫画版では、130年前に新撰組と闘い、海底に沈んでいた人造人間（最強のからくり兵器）。からくりであるが故に、造物主である黒天狗に対して絶対の忠誠を誓う。が、一度しんせん組の『龍の剣』にやられてからは、ただのからくりとしてではなく、何らかの情が生まれたようで、黒天狗の行っていることに疑問を呈する場面も見られるようになる。銀天狗によるクーデターが発覚したときには最後まで黒天狗に忠誠を誓い、そのために銀天狗に破壊されるも最後の力を振り絞ってイサミたちに助けを求めた。
銀天狗（田能久健、18?）
声 - 小野健一
四天王のリーダー格で、銀の仮面を被った男性。邪道な悪を許さない正しき悪を進む人。電光流という武術(?)を習得しており、光弾を放つといった奇怪な攻撃が出来る。仮面の下は美形。さわやかな物腰で、「まいったな?」が口癖。ノリが良く、党集会の司会なども請け負っているようだ。がんばった部下は給料アップ、仕事の合間に差し入れを持って現場に現れるなど、部下への気遣いも細やかである。とっさの事態には「正義の味方」然とした行動をとってしまうらしく、しんせん組にも「銀天狗さんありがとう!」とお礼を言われてしまう。表の顔は芹沢重工社長で、（半ば冗談ではあるが）自称「ルリ子の婚約者」。
漫画版では4巻から登場。容姿そのままに様々な悪の陰謀を張り巡らせる悪の天才科学者として、しんせん組の前に立ちはだかり、たびたび主人公たちをピンチに陥れる。その悪どさはハンパではなく、最終的には根回しと陰謀を巡らせて四天王を率い、からくり天狗と黒天狗（＝芹沢）を孤立させて追放し、黒天狗党を乗っ取りイサミたちの最大の敵として立ちはだかるなど、アニメとは性格が180度回転 し、今作最大の悪党として大変貌を遂げている。なお『ダッシュ』ではイサミたちに敗れたことから改心し、アニメ版と同じ性格となっている。鴨之丞が遠き星に離れた後の黒天狗党および芹沢ジャパンを率い、イサミたちの力となるべく暗躍している。
ゴールデン天狗（印堂陽、18?48）
声 - 稲葉実
顔が金色で笑った顔をした天狗のお面をつけている。レーザー兵器、宇宙船、バイオケミカル、特殊なイースト菌等、からくり天狗とはまた違った、科学分野の研究、開発を担当。ズボンのゴムが緩く、ベルトも締めないので、しょっちゅうパンツを見せてしまうのが悩みの種だが、その理由は「ベルトを締める時は本気を出す時」だから。幻術などを得意とする。マジックの腕と物忘れの激しさは天下一品。終盤、からくり天狗同様、クーデター失敗の後黒天狗党を抜けて新撰組に挑んだ。表の顔は芹沢運輸社長。
エレキ天狗（平賀源兵衛）
漫画版の4巻に登場する130年前の黒天狗四天王。平賀源内の孫で、洗脳され協力していた。
黒天狗裏四天王
1995年8月16日に放送された『イサミ ファンクラブ』に登場する。影のみの登場でどのようなキャラクターなのかは不明。佐藤竜雄監督は「影となって芹沢会長を助けている。明らかになるのは後々。」と言っていて、『飛べ!イサミ メモリアル』の特別読切にその活躍が描かれた。
宇宙天狗
かぶりもの天狗
密林天狗
料理天狗
シェード ロコシ ネオクラ アマウ シブル トラジャ リーデ トーンダ フラット ジャス とうおん スウェット フラッシュ シェル オイデ チッタ ブーティ アサガオ なるこ オクナ ミックス るりこん スミド ベリドット のえいう セジュ カズラ ソフト アンチーク リジン リンネ ビリヤ モノリス ビオラ ダメージ ライアド ピアサ ドーナ てんめん ヌンチャ イザヤ タービン リーチ しょうたく プレー グザグ グルス 三番目 花かんざし リッジ
カラス天狗
7号（鳥丸ヒロ子）
声 - 渡辺久美子
序盤では非道な性格描写がされている。初出の第9話『しのびよる影』のみ担当声優がくればやしたくみ。物語中盤において、新撰組、花丘博士の件の度重なる失敗により、カラス天狗77号、加えて掃除のおばちゃんに降格し、この頃からギャグキャラに転身。しかし終盤では、黒天狗自身の計らいにより見事7号に復帰、その際からコスチュームが銀天狗からプレゼントされた白い忍装に変わった。銀天狗のことが好きで「銀さま」と慕っているが、クモ男となんだかいい雰囲気になったこともある。
50号（教頭）
声 - 茶風林
正体はイサミ達の通う小学校の教頭。学校でのイサミの監視にあたる。メガホンを持っていることが多い。若い頃は映画青年だったらしく、それが元で黒天狗党の「宇宙船兵器」のPV監督に抜擢された。自身のかつての教え子たちも黒天狗党にカラス天狗として、かなりの人数が所属おり（カラス天狗大江戸小学校同窓会）、PV製作の際には「恩師のピンチを見捨てはおけない」と駆けつけていた。また、銀天狗とは旧知の仲らしく、彼を「ぼっちゃん」（銀天狗は50号を「先生」）と呼ぶ。
59号（平助）
声 - 亀山助清
重助と共に花丘家監視の任務についている。中盤からは黒天狗四天王の指令を受け様々な任務をこなす。しかし、イサミ達にやられたり成功しても報酬をはぐらかされたりで下っ端見習いのままである。抜け目がないようでかなり間抜け。
63号（重助）
声 - 桜井敏治
平助を兄貴と慕い共に任務についている。子供の頃から特撮ヒーローが大好きで、今も小学生達のようにガンバマンのファンである。
関係者
クモ男（5、15,39）
声 - 家中宏
イサミたちと3度戦うことになる怪盗。黒天狗党に属してはいない（密かに黒天狗の命を受けることもある）が、カラス天狗7号たちと協力する。服の下は筋肉隆々の肉体を持っている。
東上別府菊丸
声 - こおろぎさとみ
天才だが、ひねくれ者のいたずらっ子。根は素直な性格で自分を叱ったイサミに好意を持っている。眼鏡を外すと美少年。
からくり天狗の甥にあたるが設定の差異により、アニメのみの登場。
ニイハオ姉妹（シスターズ）
花丘博士を追って黒天狗党香港支部からやってきた3人の姉妹。彼女らに負けたことが、後半のしんせん組の変身へつながる。しんせん組の正体を暴くところまで行くが、からくり天狗の卑怯さに幻滅し黒天狗党を裏切る。ちなみにニイハオ姉妹の呼称は各メディアなどによる番組紹介で用いられたものの、物語中で直接用いられることはなかった。『ダッシュ』では、海外で白狐団と戦っている描写で1コマのみ登場。
ジャスミン
声 - 水谷優子
長女。胸元の大きく開いたチャイナドレスがトレードマーク。戦闘能力は非常に高く、変身前のしんせん組を打ち負かした最初の存在であり、黒天狗党内部では初めて彼らの正体を暴いた人物である。ナルシストで、暇さえあれば鏡で自分の顔を見ている。
タピオカ
声 - KAKO
次女。拳法を中心としたその肉弾戦のスキルは、カラス天狗はおろか花丘博士とも渡り合う。
声を演じたKAKOは、初期エンディングを担当したSEEKのボーカル。
ライチ
声 - 稀代桜子
三女。鈴を用いた幻術を得意とするが、肉弾戦も出来ないわけではない。様々な人から慕われているイサミへの妬ましさから一人で先走って勝負を申し込むが、ジャスミンに諭されてからは純粋にライバルとしての勝負を望むようになった。漢字が苦手。
白狐団
『飛べ!イサミ ダッシュ』に登場。神の名を騙ることが多い。
野火
ニセフージン
ニセライジン
ニセヘルキス
ギリシャ神話のヘルキスをモチーフにしたキャラクター。
この節は執筆中です。加筆、訂正して下さる協力者を求めています。
組織
黒天狗党
黒天狗を頂点とする世界征服をたくらむす悪の組織。黒天狗党の本部は芹沢ジャパンビルの地下深くにある。また香港など海外にも支部があるらしい。
芹沢グループ
芹沢鴨乃条が会長を務める巨大財閥。グループ内に黒天狗党の幹部が多数在籍しているが、黒天狗党の存在はグループ内でも秘匿されている。関連企業として、からくり天狗が社長を務める芹沢電機工業、ゴールデン天狗が社長を務める芹沢物産などがある。
新撰組発明係
新撰組本隊とは別に現大江戸市を中心に黒天狗党と戦っていた、イサミ・トシ・ソウシの先祖である花丘一作・月影十郎・雪見千助が所属していた部隊。発明係とはこの三人が発明好きのため勝手に名乗っていただけである。
瑠美乃一族
ルミノタイトを黒天狗党から守る事を宿命とする忍者。代々に渡って黒天狗党と戦ってきた。現頭領はイサミ達の担任でもある高木はるか。